Дифтерия

ифа дифтерия

1.1. В методических рекомендациях (далее — МР) представлена рациональная и эффективная тактика использования серологических методов диагностики и мониторинга иммунитета к дифтерийной инфекции.

1.2. В настоящих МР описаны используемые в последние годы международные и отечественные методы определения противодифтерийных антител, а также предложен наиболее надежный и перспективный метод иммуноферментного анализа (далее — ИФА) для определения суммарных и высокоавидных антител, его стандартное применение, в том числе предложены надежные критерии оценки защитных уровней, необходимые для выявления среди детей и взрослых групп повышенного риска и оценки напряженности индивидуального и коллективного иммунитета к дифтерийной инфекции.

1.3. Настоящие МР предназначены для врачей-эпидемиологов и микробиологов и носят рекомендательный характер.

2.1. Несмотря на высокие показатели привитости населения от дифтерии в разных регионах России периодически регистрируются случаи заболевания дифтерией или носительства Corynebacterium diphtheria, особенно среди лиц в закрытых коллективах [3, 4, 8].

2.2. В настоящее время, спустя 15 лет после прошедшей эпидемии дифтерии, повсеместно отмечается снижение внимания клиницистов к этой инфекции. Профилактические и диагностические обследования проводятся, но не в полном объеме [12].

2.3. Как известно, защищенность от дифтерии в нашей стране определяется с помощью реакции прямой гемагглютинации (РПГА) [13]. Однако результат реакции, выражаемый в титрах, не позволяет точно определить количество антитоксических антител (АТ-АТ), а, значит, и оценить состояние иммунитета против дифтерии. Разработка и повсеместное внедрение в практику оценочной шкалы защищенности от дифтерии на основании определения количества АТ-АТ позволили контролировать качество вакцинации 1 [14]. Однако информация о количестве вырабатываемых противодифтерийных антител не всегда дает достоверный ответ на вопрос о степени защищенности от дифтерии. Это было продемонстрировано во время последней эпидемии дифтерии в России и после нее, когда у заболевших (до 40 % случаев) находили в крови АТ-АТ зашитых уровней [9, 10]. Проведенными исследованиями установлена определяющая роль высокоавидных АТ-АТ в защите от дифтерии, которые могут быть определены наряду с количеством суммарных АТ-АТ в иммуноферментном анализе [2, 5, 6, 16]. При этом была показана динамика формирования и утраты АТ-АТ, равно как и показателя их авидности, изучены особенности специфического иммунитета к дифтерии среди различных групп населения [1, 7, 11, 15]. Тем не менее, отсутствие программ и схем исследования при диагностике дифтерии и изучении напряженности иммунитета у населения, содержащих новые аргументированные данные, не позволяют полноценно и качественно проводить бактериологический и иммунологический контроль в отношении защищенности к дифтерии на местах.

1 МЕ/мл — стойкая длительная невосприимчивость к дифтерии.

3.1. Для постановки методов при проведении контроля иммунитета населения к дифтерии необходимо соблюдать требования санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2008 № 4 (зарегистрировано в Минюсте России 21.02.2008 № 11197).

3.2. Список оборудования и материалов, необходимых для проведения исследования, представлен в прилож. 1.

4.1. Серологический контроль состояния иммунитета
у детей и подростков

4.1.1. Серологический контроль иммунитета в различных группах позволяет представить иммунологическую структуру населения и выявить группы повышенного риска, определить состояние вакцинального иммунитета как в ранние, так и в отдаленные сроки после вакцинации.

4.1.2. Серологический контроль состояния и длительности сохранения вакцинального иммунитета необходимо осуществлять систематически методом выборочного серологического обследования (мониторинга) различных групп населения в городах и сельских районах каждой области, края.

4.1.3. Обследованию подлежат привитые против дифтерии дети и подростки от 3 до 18 лет каждой возрастной группы (3 года, 4 года, 5 лет и т.д., особое внимание следует обратить на детей 9 — 13 лет).

4.1.4. Серологический контроль следует проводить, начиная с групп детей 3 лет не ранее, чем через 6 месяцев после последней прививки. К этому возрасту должен быть закончен первичный вакцинальный комплекс против дифтерии, включающий вакцинацию и первичную ревакцинацию (V и RV).

4.1.5. В случае отсутствия материально-технических возможностей обследования каждой возрастной группы детей и подростков можно отобрать возрастные группы, подлежащие очередной ревакцинации (4 — 5 лет, 9 — 10 лет, 14 — 15 лет).

4.1.6. При получении неудовлетворительных иммунологических показателей в этих группах контроль за иммунитетом следует провести в каждой возрастной группе.

4.2. Серологический контроль состояния иммунитета у взрослых

4.2.1. Наиболее подвержены заболеванию дифтерией следующие группы «риска»: лица старше 50 лет; рабочие промышленных предприятий, особенно занятые на вредном производстве; лица, страдающие туберкулезом, а также гепатитом С, СПИД, наркоманией и алкоголизмом.

4.2.2. Особое внимание должно уделяться лицам в закрытых коллективах.

5.1. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)

Для определения уровней сывороточных АТ-АТ в крови здоровых людей в нашей стране используют реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА), которая рекомендована методическими указаниями МУК 4.2.3065-13 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции», утвержденными Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 14 июля 2013 г. Эта реакция имеет свои преимущества, состоящие в простоте постановки, быстроте получения результатов и экономичности.

Для постановки реакции используется диагностикум дифтерийный эритроцитарный антигенный. Поскольку срок годности эритроцитарных диагностикумов составляет 1 год, необходимо перед каждым проведением серологического исследования сывороток проверять активность препарата. Проверка проводится с контрольным антитоксином, приложенным к комплекту, либо используется национальный препарат дифтерийного антитоксина, очищенного ферментолизом и специфической сорбцией, диагностический сухой. Допускается исследование контрольной сыворотки (лабораторный образец) с известным титром дифтерийных антител. Если диагностикум выявляет в сыворотке антитела в концентрации на 2 — 3 разведения ниже, чем они в ней содержатся, то такой препарат не пригоден для дальнейшего исследования.

РПГА ставят в два этапа согласно инструкции, прилагаемой к препарату: 1-й — подготовка к реакции; 2-й — основной опыт. Ответ может быть получен на 2-е сутки с момента получения исследуемого материала лабораторией.

Однако ряд зарубежных исследователей отмечает возможность получения ложноположительных данных и несовпадение результатов, полученных в реакции нейтрализации in vivo и методах in vitro. По данным ряда авторов коэффициент корреляции между результатами, полученными в РПГА и PH, составляет всего 0,6.

5.2. Реакция нейтрализации (PH) в культуре клеток Vero

Как известно, «золотым стандартом» при определении антитоксических противодифтерийных антител является кожная проба на кроликах или морских свинках. Однако результат в этом тесте можно получить лишь спустя 4 — 7 дней, что ограничивает его применение при проведении исследований в клинической лаборатории, где результат должен быть получен в минимальные сроки.

Поэтому в качестве второго стандарта была принята реакция нейтрализации (PH) в культуре клеток Vero, поскольку она лишена недостатков биологического теста, более стандартна и наглядна. Коэффициент корреляции результатов, полученных в PH в культуре клеток Vero, с результатами, полученными в классическом методе (на лабораторных животных), составляет 0,98. Этот метод гораздо экономичнее, быстрее и проще в постановке. Однако достоверность результатов PH во многом определяется стандартностью культуры клеток и всех контролей (токсинов и антитоксинов).

В реакции используется цветная проба, основанная на способности токсина изменять метаболическую активность зараженных клеток, что определяют по цвету индикатора, содержащегося в питательной среде. В не пораженных токсином культурах клеток под влиянием выделяющихся продуктов клеточного метаболизма pH питательной среды сдвигается в кислую сторону, вызывая изменение цвета индикатора. В пораженных токсином культурах в результате дегенерации клеток их метаболическая активность подавляется, и цвет фенолового красного не изменяется или изменяется частично.

В реакции используется токсин 0,0002 Lf/мл и антитоксин 0,032 МЕ/мл (National Collection of Type Cultures Diphtheriae Reference Laboratory, Central Health Laboratory (CPHL), London, UK). При постановке реакций применяют культуру клеток Vero, получаемую из лаборатории детских вирусных инфекций НИИЭМ им. Пастера, в концентрации 2,5 ⋅ 10 5 клеток/мл. Содержание антитоксических антител определяют от 0,000125 МЕ/мл и выше,

5.3. Иммуноферментный анализ (ИФА)

В последние годы совершенствование иммунотехнологии позволило использовать иммуноферментные методы для определения антител, в том числе противодифтерийных. Эти реакции отличаются стабильностью, быстротой, удобством в постановке. В связи е этим в нашей стране (НПО «Биомед», Пермь) разработана и имеет регистрационное удостоверение № 09/600/22116 тест-система на основе твердофазного ИФА с адсорбированным в лунках планшета очищенным дифтерийным анатоксином. Конъюгатом служат иммуноглобулины (F(аb’)2-фрагменты) диагностические против IgG человека, аффинноочищенные, меченные пероксидазой хрена.

Тест-система для ИФА представляет собой набор, предназначенный для определения суммарных антитоксических антител, и включает следующие реагенты: иммуносорбент 1-96-луночный полистироловый или хлорвиниловый планшет для иммунологических реакций, в лунках которого сорбирован анатоксин дифтерийный очищенный; конъюгат — иммуноглобулины (F(аb’)2-фрагменты) диагностические против IgG человека, аффинноочищенные, меченные пероксидазой; контрольный положительный образец (К+) — сыворотка или плазма крови человека с известным титром дифтерийных антител; контрольный отрицательный образец (К-) — сыворотка или плазма крови человека, не содержащая дифтерийных антител; концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т×25); блокатор — белково-солевой раствор (Б); цитратно-фосфатный буферный раствор с перекисью водорода (ЦФБР); хромоген — тетраметилбензидин (ТМБ); стоп-реагент (СР) — 5 %-ый раствор серной кислоты. Специальная компьютерная программа, прилагаемая к набору, дает возможность производить перерасчет показателей оптической плотности в показатели антитоксических международных единиц.

ЧИТАЙТЕ ТАКЖЕ:  памятка дифтерия

Для определения индекса авидности противодифтерийных антитоксических антител в сыворотке (плазме) крови человека разработано дополнение к набору, которое включает в себя следующие ингредиенты: контрольный положительный образец высокоавидных антител (КА+) — сыворотка крови человека с известным индексом авидности противодифтерийных антитоксических антител (индекс авидности сыворотки указан на этикетке флакона); контрольный отрицательный образец низ-коавидных антител (КА-) — сыворотка крови человека, содержащая противодифтерийные антитоксические антитела низкой авидности; фосфатно-солевой буфер, содержащий 3М калия роданистого для определения авидности противодифтерийных антитоксических антител (ФСБ-3МКрод). Набор рассчитан на исследование 29 образцов сыворотки (плазмы) крови для определения индекса авидности противодифтерийных антитоксических антител.

Тест-система укомплектована национальным стандартом антитоксина, измеряемым в МЕ/мл. Расчет концентрации АТ проводится с учетом коэффициента по калибровочной кривой, что делает результаты более достоверными. Сравнительный анализ нейтрализующего эффекта испытуемых сывороток людей в клеточной культуре Vero и других линиях показал хорошую корреляцию (r = 0,91) с результатами, полученными в модифицированных вариантах ИФА, что подтверждает адекватность применения ИФА для измерения уровня антитоксического иммунитета к дифтерии у здоровых людей.

5.3.1. Определение уровня противодифтерийных АТ
с помощью тест-системы ИФА

1. Приготовить разведения исследуемых сывороток 1:20, 1:200, 1:2000 на буферном растворе № 1 (содержимое флакона концентрата ФСБ-Т×25 развести в 600 мл дистиллированной вода, содержимое флакона с блокатором растворить в 5,0 мл дистиллированной воды, полученный раствор добавить в емкость с раствором ФСБ-Т и тщательно перемешать) в макропланшете непосредственно перед использованием.

2. Приготовить непосредственно перед использованием рабочие разведения: отрицательной сыворотки — 1:20, добавляя в содержимое флакона (0,2 мл) 3,8 мл буферного раствора; положительной сыворотки — 1:200 (отмерить 0,01 мл растворенного К+ и добавить 2,0 мл раствора № 1), из которого затем приготовить отдельно каждое разведение — 1:2, 1:4, 1:8 и 1:16 (в итоге получить пять разведений К+ — 1:200, 1:400, 1:800, 1:1 600 и 1:3200).

3. Полистироловые планшеты с иммунобилгоированным антитоксином трижды отмыть буферным раствором (в объеме 0,3 мл в каждую лунку), удалить буферный раствор, постукивая по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге, помещенной на поддон.

4. Разведения К+ внести по 0,1 мл в лунки: А1 — 1:200, В1 — 1:400, C1 — 1:800, D1 — 1:1600, E1 — 1:3200. К- внести по 0,1 мл в лунки F1 и G1. В лунку Н1 внести 0,1 мл раствора № 1 («бланк»). Разведения исследуемых образцов сывороток крови внести по 0,1 мл в остальные лунки планшета (А2-Н12). Планшет герметично закрыть и выдержать (60 ± 5) мин при температуре (37 ± 1) °С.

6. В каждую лунку планшета, кроме Н1 («бланк»), внести по 0,1 мл раствора конъюгата (непосредственно перед использованием из флакона отобрать необходимый объем конъюгата и развести его раствором № 1 до указанного на этикетке рабочего разведения, тщательно перемешать). В лунку Н1 внести 0,1 мл раствора № 1. Планшет герметично закрыть и выдержать (60 ± 5) мин при температуре (37 ± 1) °С.

7. Удалить жидкость из лунок, планшеты промыть, как указано в пункте 5.

8. Внести в каждую лунку планшета по 0,2 мл раствора ТМБ (готовят непосредственно перед внесением в лунки планшетов). Для этого содержимое флакона с ТМБ перенести во флакон с ЦФБР и тщательно перемешать. Раствор готовить в защищенном от прямых солнечных лучей месте. Планшет выдержать при температуре (20 ± 2) °С в течение 20 мин в защищенном от света месте.

9. Реакцию остановить добавлением в каждую лунку по 0,1 мл стоп-реагента (СР).

10. Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре при двух длинах волн 450/620 нм. Выведение спектрофотометра на нулевой уровень («бланк») осуществляют по лункам вертикального ряда.

5.3.2. Определение индекса авидности противодифтерийных
антитоксических антител

1. Внести контрольные и исследуемые образцы. После внесения контролем К+, К- и раствора № 1 добавить КА+, КА- и все испытуемые сыворотки в двух повторностях (одну повторность КА+, КА- и рабочие сыворотки промыть раствором № 1, а вторую — 3М раствором калия роданистого). Планшет герметично закрыть и выдержать (60 ± 5) мин при температуре (37 ± 1) °С. следуя инструкции к набору дата ИФА. Затем содержимое лунок собрать в сосуд с дезинфицирующим раствором (5 — 6 % раствор монохлорамина).

2. Первая промывка планшета.

Контроли К+, К- и первую повторность КА+, КА- и рабочих сывороток промыть 5 раз раствором № 1, вторую повторность КА+, КА- и рабочих сывороток промыть 4 раза 3МКрод, а 5-й раз — раствором № 1.

3. Далее все этапы реакции выполнить согласно основной инструкции к набору.

Регистрация и оценка результатов

Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре при двух длинах волн 450/620 нм.

Индекс авидности (ИА) рассчитывают по формуле:

Источник: http://files.stroyinf.ru/Data2/1/4293755/4293755688.htm

Для диагностики in vitro. Набор RIDASCREEN® Diphtherie IgG это

иммуноферментный тест для количественного определения IgG антител к

дифтерийному анатоксину в сыворотке человека. Тест может быть использован

для уточнения иммунного статуса.

  1. Общая информация и пояснения к тесту

Благодаря тому, что строго соблюдается вакцинирование детей, дифтерия сейчас

– довольно редкое заболевание. После прививки дифтерийным анатоксином,

начинается выработка специфических антител, как ответная реакция иммунной

системы. Иммунологические методы позволяют определять эти антитела в

сыворотке крови. Анатоксин обладает такими же антигенными свойствами, как и

бактериальный токсин, но без токсического эффекта. Поэтому можно определить

и титры пост-вакцинальных IgG, и иммуноглобулинов, появившихся после

выздоровления. Сопоставимость измерений достигается за счёт корректирования

ИФА методов по международным стандартным сывороткам.

  1. Принцип теста

Дифтерийный анатоксин наносится на микролунки плашки. Антитела,

присутствующие в образце сыворотки пациента, связываются с антигенами и

выявляются во время второй инкубации, при помощи меченных ферментом анти-

человеческих антител (коньюгата). Фермент превращает бесцветный субстрат

(H2O2/TMB) в конечный продукт голубого цвета. Ферментная реакция

останавливается при добавлении серной кислоты, при этом цвет реакционной

смеси меняется из голубого в жёлтый. Окончательное измерение проводится на

плашечном фотометре при длине волны 450 нм с референсным ≥ 620 нм

  1. Поставляемые реагенты

Состав набора (Компонентов набора достаточно для выполнения 96

определений):

— Плашка 96 лунок: Микротитровальная плашка; 12 микролуночных стрипов (разборных) в стрип-холдере; сорбированные антигеном дифтерийного анатоксина;

— SeroPP 110 мл: Буфер для образцов, готовый к работе; Фосфатно-буферный раствор

NaCl, жёлтого цвета, содержит 0.01% мертиолята и 0.05% твина 20;

— SeroWP 100 мл: Буфер для промывки, 10-х концентрат; трис-буферный раствор NaCl;

содержит 0.2% бронидокса- Л и 0.05% твина 20;

— Контроль IgG + зелёная крышка 2.5 мл: Стандартный контроль IgG, готовый к работе; разбавленная сыворотка человека; зелёного цвета; содержит 0.01% мертиолята, и 0.05 % твина 20;

— Контроль IgG — бесцветная крышка 1.2 мл: Отрицательный контроль IgG, готовый к работе; разбавленная сыворотка человека; содержит 0.01% мертиолята, и 0.05 % твина 20;

— SeroG HD зелёная крышка 12 мл: Коньюгат анти-человеческих IgG (кроличьих), готов к работе; антитела, коньюгированные пероксидазой в стабилизированном белковом растворе; содержит 10 ppm проклина, 0.01% метилизотиазолинона, 0.01% Бромонитродиоксана;

— SeroSC 12 мл: Субстрат; Н2О2/тетраметилбензидин, готовый к работе;

— SeroStop 12 мл: Стоп-реагент; 0.5 М серная кислота, готовая к работе.

  1. Инструкции по хранению

Набор должен храниться при 2 – 8 °C и может быть использован после

открывания до истечения срока годности, указанного на этикетке. Растворённый

промывочный буфер должен быть использован в течение 4 недель, при условии,

что хранится при 2 — 8°C или в течение 5 дней, если хранится при комнатной

температуре 20 – 25 °C .Гарантия качества не сохраняется после окончания срока

Упаковка из фольги, в которой находятся микроплашки, должна быть открыта

таким образом, чтобы не повредился закрывающий зажим. Неиспользованные

микролунки надо сразу же вернуть назад в эту упаковку, и они должны храниться

в этой упаковке при 2 — 8 °C .

Не следует допускать контаминации реагентов, а бесцветный хромоген должен

быть защищён от попадания прямого света

  1. Материалы необходимые, но не поставляемые

− дистиллированная или деионизованная вода.

6.2. Дополнительные материалы

− Влажная камера или инкубатор на 37 °C

− Микропипетки на объёмы 10-100 μл и 100-1000 μл

− Мерный цилиндр (1000 мл)

− Плашечный промыватель или многоканальная пипетка

ЧИТАЙТЕ ТАКЖЕ:  прививка от дифтерии челябинск

− Плашечный считыватель (450 нм, референсная длина волны ≥ 600 нм)

− Контейнер для отходов с 0.5 % раствором гипохлорита

  1. Предупреждения для пользователей

Только для диагностики in vitro.

Это тестирование может выполняться только обученным и подготовленным

персоналом. Следует строго соблюдать рекомендации руководств по работе в

медицинских лабораториях и строго придерживаться инструкции по выполнению

Недопустимо пипетировать ртом образцы и реагенты, нельзя допускать контакта с

повреждёнными кожными покровами и слизистыми. При работе с образцами,

обязательно надевать перчатки и по окончании тестирования тщательно мыть

руки. Нельзя курить, принимать пищу и пить в помещении, где работают с

образцами или реагентами для тестирования.

Контрольные сыворотки, входящие в состав набора, были протестированы на

ВИЧ- и ВГС-Aт, а так же на HbsAg и показали отрицательные результаты. Но, тем

не менее, с ними следует обращаться, как с потенциально инфекционным

материалом, т.е. так же, как с образцами пациентов, и соблюдать все меры

предосторожности, согласно местным правилам по работе с инфекционными

Стандартный контроль и отрицательный контроль, а так же буфер для образцов и

промывочный буфер, содержат в качестве консерванта 0.01% мертиолят. Нельзя

допускать, чтобы это вещество попадало на слизистые и кожу.

В состав промывочного буфера в качестве консерванта входит 0.2% бронидокс Л.

Нельзя допускать, чтобы это вещество попадало на слизистые и кожу.

Н2О2 (субстрат) может вызвать ожоги. Поэтому с ним следует обращаться,

соблюдая все меры предосторожности.

Стоп-реагент содержит 0.5 М серную кислоту. Избегайте контакта с кожей и

одеждой. Если стоп-реагент попал на кожу, его необходимо смыть водой.

Все реагенты и материалы, находившиеся в контакте с потенциально

инфекционными образцами, должны быть обработаны доступными

дезинфектантами или автоклавированы при 121 °C в течение 1 часа. ВНИМАНИЕ:

Чтобы предотвратить образование ядовитых газов, все жидкие отходы,

содержащие стоп-реагент, следует нейтрализовать перед тем, как поместить их в

  1. Сбор и хранение образцов

Данный тест можно применять для образцов сыворотки крови. После взятия

крови, сыворотку необходимо как можно скорее отделить от сгустка, во избежание

гемолиза. До тестирования образцы можно хранить в холоде или

замороженными. Ни в коем случае не допускаются повторные оттаивания и

замораживания образцов и микробная контаминация. Использование образцов

инактивированных нагреванием, или с признаками липемии, гемолиза,

желтушности или мутности, может привести к ложным результатам.

Источник: http://mediasnab.com.ua/nabor-diagnosticheskij-ifa-difteriya-igg-g14507271

Для решения задачи эпиднадзора за дифтерийной инфекцией необходим качественно новый подход к лабораторной диагностике дифтерии — сокращение сроков исследования, применение более надежных и специфических методов исследования.

Совершенно очевидно, что для сокращения сроков диагностики дифтерийной инфекции необходимо подходить не с позиции выявления коринебактерий дифтерии (токсигенных и нетоксигенных), а с позиций индикации патогенного агента возбудителя дифтерии — дифтерийного токсина.

При определении дифтерийного токсина методом ИФА применяется твердофазнй вариант. Далее приводится описание метода с использованием моноклональных антитоксических противодифтерийных антител (МкАт), полученных к COOH-концевому участку В-фрагмента дифтерийного токсина, ответственного за биологическое связывание с клетками макроорганизма, и иммобилизированных на полистироле. Используются также поликлональные антитоксические противодифтерийные антитела (ПкАт), меченые ферментом пероксидазой хрена. Сорбированные на поверхности полистироловых планшетов МкАт связывают находящиеся в исследуемых пробах молекулы дифтерийного токсина (анатоксина) и не связывают никаких других продуктов микробного или иного происхождения, обеспечивая тем самым исключительно высокую специфичность метода. Свободные антигенные детерминанты молекулы токсина взаимодействуют с ПкАт, конъюгированными с пероксидазой хрена. При наличии в анализируемых пробах токсина образовавшийся комплекс моноклональные антитела — дифтерийный токсин — поликлональный конъюгат с пероксидазой проявляются индикаторной субстратной смесью перекиси водорода с 5-аминосалициловой кислотой (рисунок 2).

Учет реакции производят визуально или инструментально по изменению цвета субстратной смеси. Высокая чувствительность и специфичность метода позволяет выявить токсин в концентрации 4-8 нг/мл или 0,002 Lf/мл анатоксина. Значительным преимуществом ИФА является возможность индикации токсина непосредственно в жидкой питательной среде, в которую был произведен посев клинического образца, минуя этап выделения чистой культуры. Этот метод можно использовать как для качественного (по принципу «да — нет»), так и количественного определения дифтерийного токсина. Пробы ставят в дубликатах — по 2 лунки для каждой пробы.

Схема проведения иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления

Ат Аг Ат Аг Ат Е

Ат Аг Ат Ат Е Е

ИЗМЕРЕНИЕ

ПРОДУКТА СУБСТРАТ Е Ат Аг Ат

РЕАКЦИИ

отмывка Ат

Условные обозначения:АТ — иммобилизированные антитоксические противодифтерийные антитела; АГ — определяемый антиген (дифтерийный токсин); АтЕ — конъюгат (антитоксические антитела — фермент)

РНГА — двухкомпонентная реакция, предполагает использование диагностикума эритроцитарного дифтерийного антительного, действующим началом которого являются связанные с эритроцитами очищенные специфической сорбцией поликлональные антитоксические противодифтерийные антитела, вступающие во взаимодействие лишь с дифтерийным токсином — анатоксином. Учитывая возможность появления неспецифической агглютинации в первых лунках планшетов за счет высокой концентрации белка, при постановке РНГА все исследуемые пробы анализируются в серийных разведениях. При наличии в исследуемой пробе токсина, образуется специфический комплекс дифтерийный токсин — сенсибилизированные эритроциты — антитоксические антитела, формирующий осадок в виде агглютината эритроцитов. Чувствительность практически не уступает ИФА.

Сравнительное испытание методов — реакции преципитации в агаре (метод традиционной бактериологии), РНАт, ИФА, РНГА показало преимущество ИФА и РНГА по чувствительности, специфичности, времени проведения анализа. ИФА и РНГА позволяют выдать ответ о наличии токсина или его отсутствии в исследуемом материале на 1-3 суток раньше традиционных методов. Чувствительность ИФА и РНГА зависит от условий культивирования исследуемого материала. Использование жидкой питательной среды позволяет выявить токсин у слаботоксигенных штаммов, продукцию которого уловить на плотной питательной среде, при постановке менее чувствительной реакции иммуно-преципитации в агаре, не всегда представляется возможным.

ИФА и РНГА могут быть применены для ускоренного выявления токсина в материале от больных дифтерией, носителей токсигенных коринебактерий дифтерии; от лиц, обследуемых с профилактической целью или по эпидемическим показаниям; а также — в культурах, выделенных на разных этапах бактериологического исследования. Кроме того, они позволяют изучить уровень токсинообразования штаммов коринебактерий дифтерии. Эти методы могут быть реализованы в бактериологических , диагностических лабораториях СЭО.

Для проведения исследований необходимы:

n коммерческая тест-система иммуноферментная моноклональная для определения дифтерийного токсина «Дифтерия-Монозим» (изготовитель — фирма «Илья Мечников» при ЦНИИВС им. И.И.Мечникова, 103064, Москва, пер. Мечникова, 5а, тел. 916-03-20);

n пипеточные дозаторы или автоматические пипетки на 100 мкл или 200 мкл (импортные или отечественного производства);

n термостат 37 0 С ;

n мерная посуда (химически чистая);

n фильтровальная бумага;

n дистиллированная вода;

n 0,85% раствор хлорида натрия, pH 7,2;

n 4% раствор гидроксида натрия (NaOH);

n 3% раствор перекиси водорода (H2O2);

n в случае необходимости инструментального учета — вертикальный фотометр для оценки иммуноферментных реакций в 96-луночных планшетах с фильтром 450 нм.

Общий принцип постановки ИФА описан на примере коммерческого набора «Дифтерия-Монозим». При использовании других коммерческих тест-систем вносят коррективы согласно инструкции применения этих систем.

Набор «Дифтерия-Монозим» содержит:

1) моноклональные антитела для адсорбции на планшетах;

2) конъюгат антитоксический поликлональный — меченные пероксидазой хрена ПкАт;

3) положительный контроль — анатоксин дифтерийный, 300 Lf/мл;

4) отрицательный контроль — среда культивирования контрольного нетоксигенного штамма коринебактерии дифтерии;

5) 5-АС — 5-аминосалициловая кислота (индикатор);

6) твин-20 — детергент для приготовления промывающего раствора;

7) планшеты полистироловые (обязательно плоскодонные в случае инструментального учета результата) для иммуноферментных реакций одноразового пользования.

Источник: http://mylektsii.ru/3-15647.html

Возбудитель дифтерии Corynebacterium diphtheriae, был выделен в чистом виде Лёффлером в 1884 г. Corynebacterium diphtheriae отличается полиморфизмом. В последние годы отмечают резкий рост заболеваемости дифтерией. Диагностика дифтерии основана на клинических и эпидемиологических данных. Для подтверждения диагноза используют бактериологический метод исследования, направленный на выявление этиологического фактора — палочки Лёффлера. Возбудитель дифтерии можно выделить через 8-12 ч в том случае, если больной не принимал антибактериальных препаратов. Однако следует учитывать, что при лечении антибиотиками (особенно пенициллином или эритромицином) до взятия материала на бактериологическое исследование роста бактерий можно не получить в течение 5 дней (либо роста не бывает совсем). В этих случаях используют серологические методы диагностики.

Из серологических методов диагностики дифтерии используют реакцию непрямой гемагглютинации и ИФА. Определяют титр антител к дифтерийному токсину в начале заболевания (1-3-й день) и через 7-10 сут, диагностическим считают нарастание титра антител не менее чем в 4 раза. РПГА отличается высокой чувствительностью и специфичностью. В последние годы на смену РПГА приходит метод ИФА, обладающий ещё большими чувствительностью и специфичностью.

При выявлении контингента для проведения вакцинации определяют титр антител до вакцинации, если он низкий или антитела отсутствуют, пациентам показано вакцинация, о её эффективности судят по нарастанию титра антител после вакцинации. Главная цель активной иммунизации — выработка специфического иммунитета. Анатоксин служит непреодолимым барьером для дифтерийного токсина и защищает организм от интоксикации.

ЧИТАЙТЕ ТАКЖЕ:  профилактика дифтерии приказ

Определение титра антител к дифтерийному токсину необходимо для диагностики дифтерийной инфекции, оценки напряжённости иммунитета у обследуемых, оценки эффективности вакцинации дифтерийной вакциной.

Титры антитоксических антител, характеризующих степень восприимчивости к дифтерии

Источник: http://ilive.com.ua/health/difteriya-antitela-k-difteriynomu-toksinu-v-krovi_75216i15984.html

Опубликовано в журнале:
Сестринское дело »» №5-6 1998 Внедрение новейших научных достижений в практику — одна из задач медицинской науки. В лаборатории клеточных гибридов НИИ вакцинаций и сывороток имени И.И. Мечникова РАМН разрабатываются новые диагностические препараты и тест-системы для быстрой и эффективной диагностики ряда инфекционных заболеваний, в том числе и дифтерии. Предлагаем вашему вниманию новые научные разработки.

Дифтерия — острое инфекционное заболевание, для которого характерно тяжелое течение. Некоторые случаи завершаются летальным исходом. Болеют дифтерией и взрослые, и дети. Вызывает заболевание микроб Corynebacterium diphtheriae, который продуцирует токсин, повреждающий клетки тканей человека. Токсин в значительной степени определяет характер заболевания. Болезнь передается от человека к человеку воздушно-капельным путем. Циркуляция микроба возрастает или, напротив, уменьшается в зависимости от восприимчивости людей к возбудителю. В свою очередь, восприимчивость или невосприимчивость зависит от того, были ли люди привиты специальной вакциной или нет, есть ли у них в крови специфические антитоксические антитела. Поэтому главным методом борьбы с дифтерией является иммунизация детей, а при необходимости и взрослых.

Для иммунизации используют комплексную адсорбированную вакцину, включающую в себя инактивированные (то есть лишенные токсического действия) корпускулярные антигены — возбудители коклюша, инактивированные дифтерийный и столбнячный токсин. Это АКДС или АДС (без коклюшного компонента) вакцины. Цикл иммунизации состоит из первичной вакцинации и ряда ревакцинаций с определенными интервалами времени. Входящий в состав вакцины инактивированный формалином дифтерийный токсин (анатоксин) в отличие от биологически активного токсина не вызывает в организме человека токсического действия, но вместе с тем способствует синтезу специфических антитоксических тел, которые нейтрализуют токсин, выделяемый попавшими в организм бактериями, и предупреждают развитие заболевания или облегчают его течение. В настоящее время ведутся исследования по усовершенствованию вакцин. В частности, показано, что в вакцину целесообразно включить не только анатоксин, но и некоторые компоненты самого микроба, чтобы в организме привитого синтезировались антитела, способные блокировать не только токсин, но и сам микроб.

Помимо иммунопрофилактики (вакцинации) для предупреждения распространения заболеваемости дифтерией важными мерами являются своевременная диагностика заболевания, изоляция больных и бактерионосителей. У привитых лиц дифтерия может протекать в легкой форме или вообще скрыто, в виде бактерионосительства, без явных признаков заболевания. Такие лица, не будучи своевременно изолированными, могут стать распространителями болезни. Вот почему после длительного отсутствия в коллективе или при приеме в детский коллектив, а также при выписке из больницы и детей, и взрослых проверяют на бактерионосительство. Берут пробы из носа и зева и исследуют их на наличие токсигенных бактерий. Такой анализ довольно продолжителен: ориентировочный ответ — через 24 часа, окончательный — через 48 часов и более. Это несколько снижает его ценность, особенно в тех случаях, когда речь идет о диагностике заболевания, когда нельзя медлить с началом специфического лечения с введением антитоксической сыворотки, чтобы предотвратить тяжелые последствия.

Вот почему в лаборатории клеточных гибридов НИИ вакцинаций и сывороток имени И.И. Мечникова РАМН (заведующий В.В. Свиридов) был разработан и апробирован на практике экспресс-метод выявления токсичных микробов. Суть его состоит в том, что взятые из зева и носа пробы помещают в жидкую питательную среду и культивируют в течение 6-8 часов. Затем жидкость исследуют на наличие дифтерийного токсина методом иммуноферментного анализа (ИФА). Такой способ высокочувствителен (выявляется 4 нанограмм токсина в 1 мл и более), специфичен, прост, демонстративен и быстр — ответ о наличии токсичного дифтерийного микроба дается через 17-20 часов. В лаборатории получены моноклональные антитела к той части токсина, которая ответственна за связь с клетками тканей и последующее его токсическое действие. Для постановки ИФА используют специальные планшеты с лунками, к поверхности которых прочно прикреплены данные антитела. В эти лунки вносят испытуемые пробы, и если в пробе есть токсин, он прочно связывается с антителами на поверхности планшета. Далее присутствие токсина выявляется с помощью специфических реагентов, дающих цветную реакцию. Интенсивность окраски меняется в зависимости от количества токсина, связавшегося с антителами. Это позволяет давать ответ не только о наличии токсигенных штаммов, но и о степени их токсичности.

Для клиники и эпидемиологической практики важно не только быстро поставить диагноз заболевания. Также важно иметь возможность количественно оценить напряженность иммунитета у отдельного человека или у больших коллективов. В первом случае это позволяет прогнозировать тяжесть течения и исход заболевания, во втором — оценить эффективность вакцинации и определить степень защищенности населения от заболевания. Наиболее распространенным методом является реакция пассивной агглютинации (РПГА). Этот метод основан на том, что в реакции используют эритроциты, на поверхности которых прикреплен анатоксин. При смешивании взвеси таких эритроцитов с испытуемой сывороткой и последующей инкубации на поверхности лунки образуется осадок эритроцитов в виде зонтика, если антитела есть, если же нет — эритроциты оседают в виде точечного плотного осадка. Для постановки такой реакции не требуется сложного оборудования и реактивов, она доступна любой лаборатории. Однако установлено, что эта реакция малочувствительна и часто дает ложно-отрицательные результаты.

Более точные данные о содержании антитоксических антител получают при постановке реакции нейтрализации токсина антителами. Она может быть поставлена на животных (этот метод используется в настоящее время для стандартизации диагностических и лечебных антитоксических сывороток, но он малопригоден для испытания сывороток, полученных от человека) или в культуре прививаемых клеток. К дифтерийному токсину чувствительны многие культуры клеток: Vero — культура клеток обезьян, СНО — культура клеток яичников хомяка и др. Клетки выращивают в специальных средах в планшетах, наблюдают за их состоянием и ростом под микроскопом. Оказалось, что под действием токсина они умирают, и степень поражения пласта клеток зависит от количества внесенного токсина. Оценить действие токсина можно под микроскопом визуально или используя специальные красители, окрашивающие только живые клетки, и судить по интенсивности окраски: интенсивность окраски убывает при увеличении дозы токсина, то есть при увеличении его повреждающего действия. Если в пробе содержится достаточно много защитных антитоксических антител, то клетки оказываются полностью защищенными и не умирают, так как антитела полностью блокируют, нейтрализуют токсин. При меньших дозах антител возможно частичное разрушение пласта клеток. При использовании серии разведений сыворотки можно найти то разведение, которое и обеспечивает полную защиту, то есть титр токсин-нейтрализующих антител.

И зарубежный, и наш опыт показал, что преимущества способа использования культур клеток для определения активности токсина и для постановки реакции нейтрализации в том, что он более прост, стандартен и позволяет давать более точную количественную оценку. Однако и этот метод имеет существенный недостаток, так как может быть использован только в специальных лабораториях, имеющих соответствующее оборудование для работы с живыми клетками. Вот почему возник вопрос о разработке такого метода оценки, который был бы доступен большинству практических лабораторий. Такой метод был разработан в нашей лаборатории. В лаборатории получены моноклональные антитела к той части дифтерийного токсина, который определяет его связь с клеткой. Полистироловый планшет, покрытый такими антителами (они прочно связаны с поверхностью лунок), будет так же связывать токсин из испытуемой пробы, как и клетка. Поэтому можно измерить количество связывающегося токсина, как при простом титровании токсина, так и при постановке реакции нейтрализации. В этих случаях количество связавшегося токсина определяется с помощью реактивов, дающих цветную реакцию, и может быть измерено.

Для оценки эффективности вакцинации и для прогнозирования течения болезни очень важно исследовать напряженность иммунитета. По данным ВОЗ, разное содержание антитоксических антител обеспечивает разный уровень защищенности человека: меньше 0,01 ME/ мл — человек восприимчив к дифтерии; 0,01 МЕ/мл — минимальная степень защищенности; 0,01-0,09 МЕ/мл — некоторая степень защиты; 0,1 МЕ/мл — защитный уровень антител; более 1,0 МЕ/мл — стойкая, длительная невосприимчивость к дифтерии.

В сравнительных исследованиях при постановке реакции нейтрализации в культуре клеток или при постановке ИФА с использованием моноклональных антител к токсину нами было показано, что имеется полная корреляция находимых уровней антител в обоих случаях. Этот метод прост, доступен любой лаборатории, точен и позволяет быстро (за 5-6 часов) получить результат.

Нина ТИТОВА, ведущий научный сотрудник лаборатории клеточных гибридов НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Источник: http://medi.ru/info/11828/

Ссылка на основную публикацию